Menu boczne

Treść strony

L/2/10.

VIOLETTA DZIEDZIEJKO

ROZDZIAŁ, IDENTYFIKACJA I PORÓWNANIE WŁAŚCIWOŚCI IZOENZYMÓW
FOSFATAZY ZASADOWEJ U SZCZURÓW Z ZASTOSOWANIEM
WYSOKOSPRAWNEJ CHROMATOGRAFII CIECZOWEJ (HPLC)
I INNYCH METOD ANALITYCZNYCH

Katedra i Zakład Biochemii i Chemii Pomorskiej Akademii Medycznej w Szczecinie
al. Powstańców Wlkp. 72, 70-111 Szczecin
Kierownik: prof. dr hab. n. med. Dariusz Chlubek

Streszczenie
Fosfataza alkaliczna (EC 3.1.3.1, ALP) jest enzymem występującym praktycznie we wszystkich tkankach [9, 23], a spełniającym swoją rolę na zewnątrz komórki [3]. Na całkowitą aktywność ALP w surowicy składa się kilka izoenzymów i wiele ich izoform pochodzących z poszczególnych tkanek [5, 23]. Szczury jako zwierzęta doświadczalne są często wykorzystywane w badaniach nad biochemią i fizjologią układu kostno-szkieletowego, a fosfataza alkaliczna odgrywa istotną rolę w mineralizacji kości [28]. Celem niniejszej rozprawy było: 1) uzyskanie rozdziału i ustalenie pochodzenia narządowego izoenzymów ALP i ich izoform występujących w surowicy szczurów, 2) porównanie właściwości surowiczych i tkankowych form ALP u szczurów oraz u ludzi, 3) ocena zmian aktywności izoformy kostnej ALP szczurów pod wpływem fluorku, 4) ocena przydatności zastosowanych metod analitycznych dla swoistego pomiaru aktywności izoenzymów i izoform ALP u szczurów. Materiałem do badań były surowice i preparaty tkanek jelita, kości oraz wątroby szczurów i ludzi. W badaniach wykorzystano dwie metody separacyjne: wysokosprawną chromatografię cieczową (HPLC) [19, 20] i elektroforezę agarozową [35]. Nowością metodologiczną było zastosowanie anionowymiennej metody HPLC do rozdziału ALP w surowicy i tkankach szczurów. Połączenie separacji HPLC z elektroforetycznym rozdziałem otrzymanych frakcji oraz zastosowanie czynników hamujących aktywność enzymu (mocznik, fenyloalanina, lektyny oraz podwyższona temperatura) (tab. 1) [9, 19, 23, 34] umożliwiło przeprowadzenie identyfikacji poszczególnych izoenzymów i izoform ALP. Zastosowanie metody chromatograficznej z reaktorem postkolumnowym pozwoliło na wyodrębnienie w surowicach szczurzych trzech izoform izoenzymu jelitowego oraz izoformy kostnej izoenzymu tkankowo-niespecyficznego (ryc. 1). Opracowana metoda HPLC charakteryzuje się wyższą rozdzielczością w porównaniu z elektroforezą agarozową w odniesieniu do subfrakcji surowiczych i tkankowych ALP u szczurów. Jednakże tylko rozdziały elektroforetyczne umożliwiają wyodrębnienie wielkocząsteczkowych form enzymu (ryc. 9). Metody nieseparacyjne miały zróżnicowaną specyficzność, lecz były cennym uzupełnieniem metod separacyjnych i okazały się bardzo przydatne dla ustalenia pochodzenia narządowego surowiczych form ALP. Zarówno u szczurów, jak i u ludzi wykazano istotne różnice we właściwościach odpowiadających sobie form surowiczych i tkankowych ALP. Pod względem aktywności izoform jelitowych i wątrobowej ALP surowice szczurów różnią się znacznie od surowic ludzkich (ryciny 1, 5), natomiast izoforma kostna u obu gatunków wykazuje bardzo podobne właściwości w surowicy i w kości (ryciny 1, 2, 5, 6). Stwierdzono ponadto, iż fluorek podawany szczurom (w postaci NaF 40 mg/L F–) jako stymulator mineralizacji kości powoduje spadek aktywności izoformy kostnej w surowicy. Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdzono, że dla dogłębnego poznania właściwości i funkcji wysoce heterogennego enzymu, jakim jest fosfataza alkaliczna u ludzi i zwierząt, niezbędne jest równoczesne stosowanie wielu nowoczesnych metod analitycznych.

H a s ł a : fosfataza zasadowa – izoenzymy – wysokosprawna chromatografia cieczowa (HPLC) – elektroforeza agarozowa – szczury. 

Powrót
do góry